CRISPR/Cas9,基因编辑技术在玉米分子育种中的应用概述

尹祥佳 翟 琛 李 晶 南 铭 郝 楠

（1 兰州职业技术学院，甘肃兰州 730070；
2 甘肃省农业科学院，兰州 730070）

党的二十大报告指出，要加快建设农业强国，扎实推动乡村产业、人才、文化、生态、组织振兴；
2023 年中央一号文件明确提出，全面推进乡村振兴，加快农业农村现代化[1-2]。因此，要立足国情农情，要将实现具有中国特色的农业现代化作为全面建设社会主义现代化国家的重要组成和战略支撑。农业现代化的基础是种子，种业又是农业的“芯片”，是国家战略性、基础性核心产业，是推动我国农业跨越式发展的重要引擎[3]。国家统计局数据显示，2022 年全国粮食播种面积11833.21 万hm2，全国粮食总产量68652.8 万t，其中玉米播种面积为4307.01 万hm2，玉米产量是27720.3 万t，分别占36.4%和40.4%，稳居我国粮食作物第1 位。

近年来，我国粮食总产量的连续增长得益于种业的发展和种子的贡献度，种业的发展离不开种业科技创新的支撑[4]。随着玉米全基因组测序技术的发展，全方位研究玉米基因功能及其应用是当前玉米分子育种研究的重要内容。CRISPR/Cas9 基因编辑技术具有易操作、效率高和扩展性强等显著优点，已成为开展玉米基础研究和应用研究最有力的遗传操作方式[5]。我国科学家在CRISPR/Cas9 基因编辑技术的研发、精准开展玉米分子育种、获得改良的玉米育种材料等方面取得了一定的突破[6]。通过阐述CRISPR/Cas9 基因编辑技术的研究历程、类型和作用原理，概述CRISPR/Cas9 基因编辑技术在玉米分子育种中的应用，实现玉米育种材料的分子改良，不断加强基因编辑作物监管，能够为玉米分子育种研究提供参考。

1.1 CRISPR/Cas9 基因编辑研究历程植物基因编辑技术是指以植物的特定功能基因为研究对象，采用基因编辑技术对这些特定基因的编码序列进行特异编辑，对基因组中的靶位点进行敲除、替换、插入等定点人工修饰，进行分子改良，最终实现植物的优良性状能够稳定遗传，经过基因组改造后的植物称为基因编辑植物。基因编辑技术有锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR/Cas9）[7]。TALENs 和CRISPR/Cas9 相继入选2012年、2013 年《科学》十大科学突破。相关研究文献对3 种基因编辑技术作了比较（表1）[8]。Ishino 等[9]于1987 年首先发现了大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在串联间隔重复序列。2002年完成了嗜热链球菌全基因组序列测序后，Horvath等[10]首次提出了CRISPR 的概念。Barrangou 等[11]于2007 年证明了细菌用CRISPR 抵御外来噬菌体的入侵，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆模式”，其实是广泛存在于细菌和古细菌中的免疫防御系统。研究表明[12-13]，天然的CRISPR/Cas9 分为Cas9、crRNA 和tracrRNA 3 个部分，crRNA和tracrRNA 通过局部碱基配对组成gRNA，而gRNA 与Cas9 结合后引导Cas9 蛋白识别和切割目标DNA 序列，后来科学家对这一编辑技术进行了改造，将crRNA 和tracrRNA 融合成1 条RNA，并称其为sgRNA。改造后的CRISPR/Cas9 成为研究者首选的基因编辑研究方法，CRISPR/Cas9 基因编辑技术成为近些年玉米分子育种研究的热点领域。

表1 基因编辑技术比较

1.2 CRISPR/Cas9 基因编辑类型目前大约有40%细菌和90%古细菌已经被测序，CRISPR/Cas类型有3 种，其中的TypeⅡ型CRISPR/Cas 较为简单，以Cas9 蛋白以及导向RNA 为核心组成，是在细胞或生物体内引入Cas9 酶和设计不同的导向RNA（sgRNA），来指导Cas9 完成对DNA 的定点切割修饰[14-15]。Type Ⅰ型是相对较为复杂的编辑系统，包含6 个Cas 蛋白质（Cas1、Cas2、Cas3、Cas5、Cas6、Cas7），主要来源于大肠杆菌等细菌、铜绿假单胞菌等古生菌，其中特征性的Cas3 蛋白具有解旋酶和核酸酶功能，是干扰阶段的主要作用酶类。TypeII 型包含4 个Cas 蛋白质（Cas1、Cas2、Cas4、Cas9），主要来源于激烈火球菌等古生菌，Cas9 是分子质量很大的多功能蛋白，能够参与crRNA 的成熟以及降解入侵的噬菌体核酸或是外源质粒，同时还在剪切crRNA 的成熟和靶标DNA 中起到了重要作用，是目前基因组定向编辑技术的主要应用类型。TypeIII 型包含4 个Cas 蛋白质（Cas1、Cas2、Cas6、Cas10），其中特征性的Cas10 蛋白质主要参与crRNA 的成熟和剪切入侵外源DNA，目前发现存在2 种亚型TypeⅢA 和TypeⅢB。自然界中的CRISPR/Cas 编辑系统具有一定的多态性，因此，立足现有的编辑系统进一步开发新型和高效的基因编辑技术也是关键的研究方向。

1.3 CRISPR/Cas9 基因编辑作用原理CRISPR/Cas9 基因编辑的作用原理分为3 个阶段。首先是来源于病毒的小段DNA 整合到细菌的CRISPR 中生成新的间隔和重复序列单元，外源DNA 的间隔序列前体侧翼有一段保守短序列称为PAM，它是获取DNA片段所需的识别序列。其次是CRISPR 在前导序列的驱动下转录出前体pre-crRNA，被特定核酸内切酶加工成crRNA，随后与反式激活tracrRNA 结合形成sgRNA 复合体，引导核酸内切酶移动至病毒DNA 的部位，指引特定的Cas9 酶降解外源核酸[16]。

所以，应用CRISPR/Cas9 基因编辑技术定向改良作物靶基因的流程一般分为6 个步骤：一是靶位点设计；
二是构建CRISPR/Cas9 sgRNA 表达载体；
三是验证sgRNA 靶向力；
四是作物遗传转化和筛选抗性愈伤；
五是分子检测和测序鉴定突变类型；
六是再生植株鉴定和后代纯合体的筛选。由于CRISPR/Cas9 编辑技术的载体构建较为简单，具有成本低等优势，在玉米功能基因验证、产量、品质和抗性改良分子育种研究中发挥了重要作用。

2.1 功能基因验证功能基因验证、挖掘有效基因为后续开展基因编辑技术或者转基因等分子育种提供了前提基础。杨敏等[17]以玉米B104 中克隆的ZmFKF1为靶基因，用CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行定点编辑，并对纯合突变体进行了表型分析和基因表达验证，明确了ZmFKF1在玉米开花过程中具有正调控的作用，为玉米分子育种及遗传改良提供了理论依据。雷海英等[18]以玉米自交系材料B104 为研究受体材料，利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术鉴定了玉米发育相关基因ZmCen，推测其与玉米植株雄花序发育有关。邢瑞霞[19]利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术成功获得了参与玉米光周期调控途径的敏感基因ZmCCT10和ZmCCT9的相关突变体，验证了改良玉米开花期，能够适当缩短生育周期。因此，通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术验证克隆基因的功能，进一步明晰功能基因与性状的关联研究具有重要的应用价值。

2.2 产量育种玉米产量提升一直是育种家的研究目标。玉米的种植产量不仅与品种的穗长、穗粗、穗行数、行粒数、粒长和粒重等数量性状相关，还与玉米种植密度和种植栽培条件有关。玉米雌花花序发育一般开始于9～10 叶期，叶腋分生组织（AM）将转换成花序分生组织（IM），随后IM 上形成多行排列整齐的小穗分生组织（SPM），因此，通过提升玉米花序分生组织活性，可以有效增加玉米果穗穗行数和粒重。Liu 等[20]利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术突变ZmCLE7和ZmFCP1等位基因资源，精细调控候选基因表达水平，强化了玉米产量性状，提高了玉米籽粒产量。徐倩等[21]用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对玉米籽粒发育关键基因ZmRLK7的2 个靶位点目标DNA 区段序列进行了突变，编辑效率均为25%，为获得稳定的变异育种材料奠定了基础。刘超等[22]从玉米自交系B73 基因组数据库中筛选了3 个穗发育相关的玉米细胞分裂素氧化酶基因CKX4、CKX5和CKX10作为靶标基因，构建了CRISPR/Cas9 玉米基因组编辑载体，为后续的玉米分子育种做了基础工作。穆路遥[23]所在研究团队在原有鉴定的3 个调控玉米百粒重的关键候选基因Zm079、Zm080、Zm081基础上，利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得了与粒重相关的4 份编辑材料，影响穗长的3 份材料，影响株型的5 份材料，为玉米产量相关基因的探究奠定了坚实基础。因此，玉米产量相关性状的基因编辑技术研究是核心的玉米分子育种目标。

2.3 品质育种在玉米品质改良方面的分子育种也是实现高质量玉米品质供给的基础和应用研究方向。张翔等[24]以玉米自交系京724 为受体材料，利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对玉米2 个香味同源基因ZmBADH2-1和ZmBADH2-2进行了突变，突变体材料中的香味物质（2-AP）含量显著提高，研究获得了香型玉米种质材料。祁显涛等[25]通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术对受体玉米材料的甜糯显性基因Sh2和Wx1定点突变形成糯性隐性基因sh2和wx1，可以快速高效地创制甜糯玉米性状的种质材料。魏晓禹[26]以H99 玉米愈伤组织为受体材料，通过对转化植株的分子检测、农艺性状调查和后代种子的品质性状检测，表明了ZmPCK2基因能够控制玉米淀粉和蛋白质含量，改良受体玉米材料的品质。因此，在产量研究的基础上能够实现CRISPR/Cas9 基因编辑改良玉米育种材料的品质，对实现更加优质的玉米品种供给非常有价值。

2.4 抗逆育种玉米在整个生长过程中受到不同程度的生物和非生物胁迫，CRISPR/Cas9 基因编辑技术在增强玉米抗旱、抗倒伏、抗除草剂和抗病等方面也有相关的研究成果报道。Shi 等[27]利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术将克隆的玉米GOS2启动子插入ARGOS8基因的5＇-UTR 或者替换ARGOS8基因的启动子，得到了2 个过表达突变体材料ARGOS8-V1和ARGOS8-V2，与对照相比具有一定的抗旱性；
Zhang 等[28]用过表达和CRISPR/Cas9 基因编辑技术证实了stiff1基因影响玉米的茎秆强度，使得玉米茎秆细胞壁中的纤维素和木质素含量发生变化，尤其是CRISPR/Cas9 实现基因敲除后玉米茎秆强度增强，具有显著的抗倒伏性；
Li 等[29]用CRISPR/Cas9 基因编辑技术实现了编码乙酰乳酸合成酶基因ZmALS1和ZmALS2的编辑，改良了受体玉米材料的抗除草剂性状，用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对ZmLOX3基因进行敲除后得到突变体材料对玉米黑粉菌的抗性显著增强。

因此，通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行功能基因验证、产量育种、品质育种和抗逆育种等方面的基础和应用研究，可以不断明晰玉米相关基因的关联性状，有效提升玉米材料的抗性，提升玉米产量和品质，为选育适应种植生长环境的优良玉米品种提供分子育种技术支撑，同时还要在研究过程中考虑到以玉米为代表的作物基因编辑监管问题。

3.1 国际基因编辑监管类型随着基因编辑作物商业化进程的不断加快，部分国家对其监管的重视程度也显著提高，基因编辑作物的研发和应用需要有政府的监管措施。目前，文献报道了国际上存在的3 种监管模式，都有相应的法律和条例依据[30]。一是以美国和阿根廷为代表的宽松监管，其与转基因作物的监管不同，仅限于产品的监管，但是做到了信息公开，监管透明；
二是以欧盟为代表的谨慎型监管，认为与转基因作物监管实质等同，要严格做到研发和应用全过程监管；
三是以澳大利亚为代表的折中型监管，在不同研发阶段进行分类监管。研究国外的监管措施能够对我国的基因编辑监管政策起到借鉴的作用。

3.2 我国基因编辑监管政策基因编辑产品监管与基因编辑产品走向市场应用具有很大的相关性。随着我国基因编辑技术的研发和应用不断取得新的成果，我国基因编辑领域的科学家及团队不断建议，尽快建立包括玉米在内的作物基因编辑监管政策。因此，农业农村部提出了尊重科学、严格监管，有序推进生物育种产业化应用的具体要求。2022 年1月农业农村部发布了新修改的《农业转基因生物安全评价管理办法》等规章的决定，还制定公布了《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》，主要针对没有引入外源基因的基因编辑植物，依据可能产生的风险申请安全评价过程。2023 年4 月农业农村部发布了《农业用基因编辑植物评审细则（试行）》，主要从分子特征、环境安全、食用安全和评审程序4 个方面细化了基因编辑植物安全评价内容，进一步明确了《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》的可操作性。4 月28 日农业农村部发布《2023 年农业基因编辑生物安全证书批准清单》，全国首个基因编辑安全证书获批。这对规范我国农业基因编辑的安全评价管理，促进我国作物育种技术研发与产业发展具有里程碑的意义。

3.3 监管对策建议包括基因编辑玉米在内的作物基因编辑研究都要有科学的研判，确保在安全可控的前提下，加速基因编辑作物研发和应用。一是要加强对国际基因编辑监管经验的吸收和借鉴；
二是要进一步完善我国基因编辑作物的安全评价体系，做到全过程信息化管理并可溯源；
三是要继续推进我国基因编辑的基础研究和应用研究，实现关键领域对“卡脖子”的突破，实现国际领先水平，提升国际竞争力；
四是要加大基因编辑技术的专利保护力度，不断提升科学研究成果转化效率；
五是要加强生物技术的科学知识普及宣传，积极营造科学认识CRISPR/Cas9 等基因编辑技术的良好社会氛围。

综上所述，CRISPR/Cas9 基因编辑技术在玉米分子育种研究过程中取得了广泛应用，获得了一批玉米育种材料，有效拓宽了玉米育种种质资源。随着基因编辑技术的发展，玉米功能基因的进一步挖掘和定点突变验证，基因编辑技术将会进一步提升我国玉米分子育种成效。同时，要与其他分子育种技术相结合，与常规玉米育种技术相结合，为培育优良的玉米新品种奠定基础。还要加强科研院所和企业的研发合作和成果转化，为我国玉米种业的现代化发展提供更加坚实的技术和人才支撑，不断助力我国农业现代化。

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