猴樟CbP5CR基因克隆及生物信息学分析

黄东莉 何敏 纪洪玲 陆林燕 严功力 张颖 张丽华

摘要 为研究猴樟CbP5CR蛋白的序列结构和功能，克隆猴樟CbP5CR基因CDS序列，进行生物信息学分析。结果表明，克隆得到的序列具有一个810 bp完整的ORF框，编码269个氨基酸，与沉水樟中收录的RWR74447.1基因序列一致性达98.88%，系统进化树的结果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有较高的保守性；
猴樟CbP5CR蛋白生物信息学分析结果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族结构域，CbP5CR蛋白化学分子式为C1242H2015N345O375S7，相对分子量28.01 kD，理论等电点7.03，结构稳定，不存在氨基酸无序化区域，为脂溶性和亲水性蛋白，磷酸化氨基酸位点有45个，亚细胞定位预测为细胞质。

关键词 猴樟；
转录因子；
基因克隆；
生物信息学分析

中图分类号 S792   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）04-0022-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）是我国重要的绿化树种、经济树种和林用树种，主要分布于我国南方地区。近几年，猴樟产业因其生长速度快、抗性强而迅速发展起来[1]，并逐渐向我国长江以北地区推广应用，而北方地区碱性土壤环境限制了猴樟的生产栽培。植物耐碱性能与其根系适应碱胁迫的策略密切相关，包括膜稳定性、抗氧化系统、渗透调节和离子平衡等方面，脯氨酸的生物合成和积累是植物应对逆境胁迫的主要方式，逆境胁迫下可以作为渗透调节物防止细胞脱水，还是生物大分子的保护剂和羟基清除剂，同时还可为植物从胁迫条件恢复而提供氮源、碳源和还原剂，耐碱性强的品种含有更高的脯氨酸含量[2]。以往研究认为，在多种胁迫条件下P5CR、P5CS、δ-OAT基因的表达量增加，而PDH基因的表达量降低，脯氨酸积累[3]，但植物体内脯氨酸的积累与植物的抗逆性之间的关系在不同植物之间存在差异，其在赋予耐受性方面的实际作用仍然存在争议。该研究基于转录组数据克隆出猴樟脯氨酸合成關系酶基因序列，并分析其特性，以期为猴樟耐碱性机理研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为耐碱猴樟变种2年生种苗，于2019年2月上旬播种，2021年4月上旬进行移栽。于2022年3月10日取猴樟枝条顶部幼嫩芽片液氮速冻后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）试剂盒提取材料的总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大连）方法去除基因组DNA后，用TR Prime Mix（random primer）进行反转录反应，获得的cDNA产物作为模板。

1.2 基因克隆

根据猴樟转录组数据，获得在耐碱性猴樟变种叶片中调控脯氨酸合成的关键酶基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计CDS扩增引物［F（5"—3"）：ATGGCAACAGCAGAGACG；
R（5"—3"）：CTAGAGAGTGTGCTACTC］，PCR反应采用25 μL体系[4]，反应产物直接转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞（TSINGKE，北京），挑单菌落进行PCR鉴定，将PCR阳性菌落培养后，提取质粒送擎科生物技术有限公司测序。

1.3 生物信息学分析

通过ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）将猴樟CbP5CR基因翻译成蛋白序列；
利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白结构域预测；
利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）对氨基酸序列的理化性质和等电点进行分析；
采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）进行蛋白质的亲/疏水性预测；
采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在线软件进行蛋白二级结构分析；
利用Fold Index 软件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折叠无序化特性分析；
采用SoftBerry ProtComp 9. 0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在线分析软件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）进行蛋白亚细胞定位；
采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）预测蛋白质三级结构，并利用PyMOL软件生成三级结构模型；
利用MEGA 7.0作出与CbP5CR的CDS序列同源性较近的物种序列进化树。

2 结果与分析

2.1 猴樟CbP5CR基因的克隆与重组载体构建

根据克隆后的凝胶电泳图片（图1），以猴樟的cDNA为模板，通过PCR扩增得到1条约900 bp的条带，片段大小与预期一致，通过测序得到长864 bp的CDS序列。PCR产物送公司测序，测序结果与沉水樟中收录的RWR74447.1基因进行比对，序列一致性高达98.88%，具备P5CR的功能。将克隆获得的基因编码蛋白通过NCBI BLAST Protein与数据库进行比对，根据比对结果显示，所克隆得到的序列具有一个810 bp完整的ORF框，推导编码269个氨基酸，将获得的目的基因命名为CbP5CR。

2.2 猴樟CbP5CR蛋白的生物信息学分析

2.2.1 猴樟CbP5CR蛋白的理化性质分析。利用Protparam软件对猴樟CbP5CR蛋白的理化性质进行分析，猴樟CbP5CR蛋白相对分子量28.01 kDa，理论等电点7.03，表明CbP5CR基因编码蛋白为中性，化学分子式为C1242H2015N345O375S7，原子总数为3 984，不稳定指数值为37.12，不稳定系数大于40时为不稳定蛋白，因而该蛋白质稳定。脂溶指数为99.85，CbP5CR基因编码蛋白为脂溶性蛋白，带负电荷的残基（asp+glu）总数为26，带正电荷的残基（arg+lys）总数为26。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白结构域预测，结果表明（图2），CbP5CR蛋白具有PLN02688家族结构域，具备脯氨酸合成酶功能。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）对猴樟CbP5CR基因编码蛋白的亲水性进行分析（图3），总平均亲水性值（GRAVY）为0.184，预测该蛋白为亲水性蛋白。通常认为，氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强，猴樟CbP5CR基因编码蛋白各氨基酸序列中第43、44位氨基酸分值最低为-2.878，亲水性值最强；
第99位氨基酸分值最高，为2.544，疏水性最强，就整体分析而言，蛋白序列中36～49、105～115、139～150、218～233位氨基酸均为连续排列的亲水性氨基酸，推测猴樟CbP5CR基因编码蛋白为亲水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbP5CR蛋白二、三级结构预测。蛋白亚细胞定位结果表明该蛋白定位于细胞质。根据蛋白二级结构在线预测结果（图4），该蛋白组成中135个氨基酸（50.19%）为α-螺旋、30个氨基酸（11.15%）为延伸主链，104个氨基酸（38.66%）为随机卷曲，因而猴樟CbP5CR主要由α-螺旋和随机卷曲组成；
利用Fold Index对猴樟CbP5CR蛋白进行氨基酸序列折叠无序化分析（图5），结果表明，该蛋白不存在氨基酸无序化区域，折叠无序化指数为0.299。利用Net Phos 3.1（https：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行蛋白磷酸化位点预测（图6），该多肽链0.500以上分值的氨基酸位点为45个，其中包含32个丝氨酸（S）、11个苏氨酸（T）和2个酪氨酸（Y）磷酸化位点。根据蛋白三级结构预测结果和同源建模分析（图7），CbP5CR编码蛋白三级结构与5bse.1.A的氨基酸序列一致性达68.28%，5bse.1.A序列的编码蛋白为Pyrroline-5-carboxylate reductase（P5CR）。

2.2.3 猴樟CbP5CR蛋白序列同源比对及系统进化树。在NCBI数据库中对猴樟CbP5CR蛋白序列进行blastp比对，根据结果下载比对得分较高的氨基酸序列，再通过MEGA 7.0软件构建CbP5CR蛋白系统进化树（图8）。结果表明，猴樟CbP5CR蛋白在进化上与同为樟科樟属的沉水樟聚为一类，说明其亲缘关系最近，樟科樟属植物中该类蛋白具有较高的保守性。猴樟CbP5CR蛋白进化树中大概分3类，其中猴樟与沉水樟归为一类，其次是绒毛状烟草、烟草、番茄、蒂罗花、黄连、博罗回和罂粟归为一类，与猴樟亲缘关系更远的石刁柏、黄石斛、深圳拟莲、薯蓣、小果野芭蕉、油棕和姜归为一类。

3 结论与讨论

脯氨酸是植物体内水合能力最强的氨基酸，具有分子量小、对细胞无毒副作用等特征，外源施用脯氨酸能够促进植物光合能力和水分利用能力[5]，还能通过诱导植物抗氧化酶活性提高抗盐碱胁迫能力。在高等植物体内，脯氨酸通过谷氨酸途径和鸟氨酸途径在细胞质、叶绿体和线粒体中合成，在线粒体内进行降解，吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鸟氨酸-δ-氨基转移酶（δ-OAT）和脯氨酸脱氢酶（ProDH）基因被认为是关键基因[2]。该研究结果表明，克隆得到的序列具有一个810 bp完整的ORF框，编码269个氨基酸，与沉水樟中收录的RWR74447.1基因序列一致性达98.88%，系统进化树的结果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有较高的保守性；
猴樟CbP5CR蛋白生物信息学分析结果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族结构域，CbP5CR蛋白化学分子式为C1242H2015N345O375S7，相对分子量28.01 kDa，理论等电点7.03，结构稳定，不存在氨基酸无序化区域，为脂溶性和亲水性蛋白，磷酸化氨基酸位点有45个，亚细胞定位预测为细胞质，研究结果为进一步研究猴樟脯氨酸代谢调控耐碱性机理提供了基础。

4 参考文献

[1] 韩浩章，张丽华，王晓立，等.猴樟与香樟幼苗的耐盐碱性比较［J］.西部林业科学，2019，48（5）：7-14.

[2] 邢晓琳.外源脯氨酸和水杨酸对盐碱胁迫下紫花苜蓿生理特性及抗氧化酶基因表达的影响[D].沈阳：辽宁大学，2020.

[3] KIARASH J G，AMIN B，MALIHE A，et al.Effects of salinity stress on proline content and expression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase and vacuolar-type H+ subunit E genes in wheat[J].Plant Genetic Resources，2020，18（5）：334-342.

[4] 韩浩章，张丽华，李素华，等.猴樟CbP5CS1基因克隆及表达载体构建[J/OL].分子植物育种：1-9.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

[5] NOREEN S， AKHTERM S， YAAMIN T， et al. The ameliorative effects of exogenously applied proline on physiological and biochemical parameters of wheat （Triticum aestivum L.） crop under copper stress condition[J]. J. Plant Interact，2018，13：221-230.

（責编：王慧晴）

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