罗氏沼虾nanos1基因克隆、表达及亚细胞定位

周 南 ，王亚坤，洪坤浩，魏 捷，于凌云 ，朱新平

1. 浙江海洋大学 水产学院，浙江 舟山 316000

2. 中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东 广州 510380

罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii) 隶属长臂虾科、沼虾属。原产于东南亚，20世纪70年代末引进国内，因其生长快、个体大且风味鲜美，逐渐成为淡水养殖的主要品种之一[1]。与其他甲壳类动物一样，罗氏沼虾也表现性别两态性：同龄雌、雄虾个体的大小、生长速度相差悬殊，在相同养殖条件下雄虾生长速度较雌虾快，性成熟后的个体平均体质量约是雌虾的2倍[2-3]；
此外，笔者发现体质量仅为6 g的雌虾和仅2 g的雄虾也有部分个体达性成熟，这些性早熟个体提前产生配子、交配繁殖会导致大量的能量损耗，造成个体发育停滞、大小不一。因此，开展罗氏沼虾生殖发育及其调控机理的研究对其产业发展具有重大意义。当前，在罗氏沼虾性别发育方面已有一定的研究基础，如在挖掘生殖发育相关基因方面，已获得了AG、Dmrt、vasa、GnRH、IAG、IAGBP等基因[4-11]；
在基因功能及其应用方面，将IAG基因的dsRNA注射到罗氏沼虾幼体中，首次成功在甲壳类动物上获得性逆转的伪雌个体，其与正常雄性个体杂交后能获得全雄个体[12]。上述研究证实这些基因在罗氏沼虾性别发育过程中发挥着重要作用。然而与脊椎动物相比[13-14]，罗氏沼虾生殖发育及其调控机理的研究仍相对薄弱。

在前期工作中，笔者在罗氏沼虾性腺转录组数据库中快速筛选到一个与脊椎动物生殖发育高度相关的候选基因——nanos。Nanos是一种RNA结合蛋白，具有2个高度保守的锌指结构域 (-CCHC-)，其在生殖发育中起着至关重要的作用[15]。作为一个具有母源效应的基因，nanos基因在不同物种中存在不同的同源物及调节功能；
如在果蝇 (Drosophila) 中，nanos基因拥有1个同源基因，该基因对生殖细胞的迁移、体细胞的抑制以及干细胞自我修复的维护起重要作用[16]；
而在线虫 (Caenorhabditis elegans) 中发现该基因有3种nanos同源物 (nanos1、nanos2、nanos3)，其中nanos1和nanos2可维持生殖细胞的生存能力[17]，而nanos3在雌雄同体的线虫中主要控制着雌雄性别转换[18]；
在脊椎动物斑马鱼 (Danio rerio) 中，nanos1基因在胚胎发育时期负责原始生殖细胞的存活，在成体斑马鱼中维持卵母细胞的生存；
而在小鼠 (Mus musculus) 中，nanos2和nanos3在生殖细胞生长发育中起作用，敲降nanos2基因会导致雄性小鼠的精原细胞丧失以及精子质量下降，而阻断nanos3的表达则可完全导致两性生殖细胞的发育停滞[19-20]。此外，nanos基因家族的表达模式因物种差异也存在不同；
如海葵 (Nematostella vectensis) 的 nanos基因在早期胚胎的多种体细胞中表达[21]；
而在水螅 (Hydra) 中，nanos存在于多功能的间质细胞中，这类细胞最后分化成不同的体细胞和生殖细胞[22]。在甲壳类动物中nanos家族基因的研究较为薄弱，仅见在河南华溪蟹 (Sinopotamon henanense) 中获得了nanos1和nanos2基因，并推测其对卵巢发育起重要调控作用[23]。其次，在公共数据库中搜索到中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)、凡纳滨对虾 (Penaeus vannamei)、美洲钩虾 (Hyalella actecananos) nanos基因及其同源物的序列。为了解nanos1基因在罗氏沼虾生殖发育中的功能，本研究从罗氏沼虾转录组中获得nanos1基因序列并扩增，随后进行结构分析及预测，并对该基因在罗氏沼虾不同组织和不同胚胎发育时期以及幼体时期进行表达模式与表达水平分析，最后通过原位杂交技术对该基因的mRNA表达分布进行亚细胞定位，以期为罗氏沼虾生殖发育的机制研究提供参考。

1.1 实验材料的收集及处理

选取3月龄健康的罗氏沼虾 (购自佛山三水白金有限公司) 雌、雄各20尾进行解剖。分别采集脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺、鳃、肠和眼等组织，放入液氮中速冻，随后转入—80 ℃冰箱保存，用于各组织RNA的提取；
取部分性腺组织，放入波恩氏液中固定8 h后转入体积分数为75%乙醇中，于4 ℃冰箱保存，用于石蜡切片；
采集卵、胚胎发育和早期发育不同时期的样品，放入液氮中速冻，于—80 ℃冰箱保存，用于后续实验。

1.2 不同组织总RNA提取及cDNA合成

将采集的组织进行裂解，使用Eastep®Super试剂盒 (Promega，中国) 提取总RNA，RNA的浓度和纯度由Nano QTM分光光度计进行测定 (Thermo，美国)，其完整性由质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将合格的RNA保存于—80 ℃冰箱中。随后使用M-MLV反转录试剂盒 (Invitrogen，美国) 进行cDNA转录和合成。

1.3 性腺组织Mrnanos1 cDNA的克隆

根据本实验室罗氏沼虾性腺转录组测序所得的nanos1基因 (Mrnanos1) cDNA序列 (序列未公布)，设计上下游特异引物nanos1 F和nanos1 R(表1)。以性腺cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 2 min；
94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃90 s，38个循环；
72 ℃ 10 min。PCR产物使用Gel Extraction Kit (Omega，中国) 试剂盒回收。然后将目的片段连接至pMD19-T (TaKaRa，中国) 载体，转化至DH5α感受态细胞 (TaKaRa，中国) 中克隆筛选，并将阳性克隆菌株送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，测序后进行比对，将比对一致的阳性菌株扩大培养，提取质粒，于—20 ℃冰箱中保存。

1.4 Mrnanos1 cDNA序列分析

利用Sequence Manipulation Suite (SMS) (http://www.bio-soft.net/sms/) 分析nanos1核苷酸和氨基酸序列，用简单模块化体系结构研究工具 (SMART)(http://smart.embl-heidelberg.de/) 预测其蛋白质结构域，通过NCBI中的BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 对MrNanos1氨基酸序列与其他物种的Nanos蛋白家族氨基酸序列进行同源比对，用DNAMAN和BioEdit进行多个序列比对分析；
采用MEGA 7.0软件中的最大似然法 (Maximum Likelihood Estimate, MLE) 构建系统进化树。

1.5 Mrnanos1在不同组织中的表达

根据Mrnanos1序列，设计引物nanos1 F和nanos1 R (表1)，并以β-actin 为内参基因 (Gen-Bank No: AY626840)，以脑、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺 (雌、雄)、鳃、肠和眼组织的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增 (Labcycle Standard，德国)，以确定Mrnanos1在不同组织中的表达分布。反应程序为：94 ℃ 2 min；
94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，38 个循环；
72 ℃ 延伸 10 min。RT-PCR产物由质量分数为1%琼脂糖凝胶进行分离，并使用凝胶成像分析系统拍照 (GenoSens2200，中国)。

1.6 Mrnanos1在卵、胚胎和早期发育时期的表达

提取 (卵) 未受精期、(卵) 受精期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、前溞状幼体期、溞状幼体期、幼体期的RNA进行逆转录，以逆转录的cDNA为模板进行qPCR扩增以确定Mrnanos1在卵、胚胎和早期发育时期的表达模式，每组3个平行，引物见表1。反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；
95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。溶解曲线程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。显著性分析采用SPSS 13.0软件的Duncan"s法进行多重比较，当P<0.05时差异显著。

1.7 原位杂交

使用 E.Z.N.A.®Plasmid DNA Mini Kit I试剂盒(OMEGA，中国) 提取罗氏沼虾nanos1 cDNA片段质粒，用回收的质粒进行PCR扩增，引物参照表1；
切胶回收，用Eastep®Gel and PCR Cleanup Kit试剂盒 (Eastep，中国) 将PCR产物进行回收，用分光光度计检测浓度。使用SP6/T7 Enzyme Mix(Roche, Germany)、Digoxigenin (DIG) RNA Labeling 试剂盒 (Roche，德国) 依照说明书合成正、反义探针。将1.1中脱水保存的组织样品复水处理后，用石蜡进行包埋，使用石蜡切片机 (FECIA徕卡轮转式切片机RM2016，中国) 进行连续切片，切片厚度5 μm，用石蜡摊片机和烘干机 (浙江科迪仪器设备有限公司) 进行展片和铺片。随后在二甲苯、乙醇中进行脱蜡和脱水。连续切片后，一张石蜡切片用苏木精、伊红进行染色 (HE)，两张石蜡切片用地高辛标记的RNA探针 (正、反义探针) 进行ISH处理。原位杂交具体操作步骤参照Yu等[24]，有阳性信号后进行封片。使用倒置荧光成像系统(Nikon Ri2，中国) 进行观察和拍照。

表1 本研究所用的全部引物Table 1 All primers used in this study

2.1 Mrnanos1 cDNA序列特征

克隆获得Mrnanos1基因 (GenBank No:ON155838) cDNA序列长为2 811 bp，5" 端非编码区 (UTR) 686 bp，3"-UTR 1 396 bp，开放阅读框(ORF) 729 bp，编码243个氨基酸。对 MrNanos1氨基酸序列进行预测发现该蛋白具有两个保守的-CCHC- (-Cys-Cys-His-Cys-) 锌指结构域，以及nanos家族特有的结构功能域 (图1)。

2.2 Mrnanos1系统发育

采用MEGA 7.0以最大似然法构建nanos系统发育树，并对Mrnanos1序列进行同源性分析。结果表明，nanos基因家族分为了2个大支 (图2)：一个分支为Nanos1蛋白分支聚集，另一个为Nanos2和Nanos3蛋白分支聚集。系统发育树结果显示，MrNanos1与其他物种的Nanos1蛋白集合聚集在一起，且与中华绒螯蟹聚集在一个分支，本研究获得的罗氏沼虾nanos基因属于nanos1基因家族。为了进一步了解Mrnanos1基因的同源性，将MrNanos1氨基酸序列与鱼类、两栖动物和哺乳动物的氨基酸序列进行比对和鉴定 (图3)。发现Mrnanos1基因的锌指序列与其他动物的高度同源。在Nanos1集簇中，Mrnanos1序列与中华绒螯蟹Nanos的同源性最高 (51%)，与鱼类的同源性较高，与青鳉(Oryzias latipes) nanos1a和大西洋鲑 (Salmo salar)nanos1的同源性分别为40.7%和46%，与非洲爪蟾 (Xenopus laevis)、小鼠和人 (Homo sapiens) 的nanos1分别有40%、22%和23%的相似性；
而在Nanos2和Nanos3的聚类中显示出较低的相似性。

图2 MrNanos1氨基酸序列与其他物种Nanos家族蛋白的系统进化树分析Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of MrNanos1 amino acid sequence with Nanos family proteins of other species

图3 罗氏沼虾MrNanos1与其他物种锌指区域结构的比较Fig. 3 Multiple alignments analysis of zinc finger domain of MrNanos1 in M. rosenbergii and other species

2.3 Mrnanos1 mRNA组织表达分析

为了解Mrnanos1在不同组织中的表达模式，以β-actin为内参基因，利用RT-PCR技术进行检测，分析Mrnanos1在正常雌雄个体的肝胰腺、心脏、性腺、肌肉、鳃、肠、脑和眼等不同组织中的表达分布 (图4)。结果显示，nanos1仅在卵巢中检测到表达，在雌性其他组织以及雄性的所有组织中均未见表达。

图4 Mrnanos1基因在罗氏沼虾不同组织中的表达分析Fig. 4 Expression analysis of Mrnanos1 gene in different tissues of M. rosenbergii

2.4 Mrnanos1在卵、胚胎和早期发育过程中的表达模式

为了解Mrnanos1在卵、胚胎和早期发育过程中的表达模式，对卵、胚胎等样品进行了qPCR检测 (图 5)。结果显示，Mrnanso1 mRNA 在 (卵) 未受精期表达量最高，显著高于 (卵) 受精期，极显著高于卵裂期和胚胎发育其他时期 (囊胚期、原肠期、前溞状幼体期、溞状幼体期) 及幼体期；
在胚胎发育期间， (卵) 受精期表达量最高，显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期 (囊胚期、原肠期、前溞状幼体期、溞状幼体期)；
而该基因在卵裂期的表达水平显著高于囊胚期、原肠期、前溞状幼体期和溞状幼体期；
在囊胚期、原肠期、前溞状幼体期、溞状幼体期和幼体期表达水平较低且无显著差异。

图5 罗氏沼虾nanos1在不同胚胎发育时期及早期幼体中的相对表达量注：字母不同表示同一时间各实验组之间存在显著性差异 (P<0.05)。Fig. 5 Relative expression level of nanos1 in different embryonic develomental stages and larvae of M. rosenbergiiNote: Different letters indicate significant difference among the experimental groups (P<0.05).

2.5 Mrnanos1在卵巢组织中的亚细胞定位

利用原位杂交技术研究Mrnanos1在罗氏沼虾卵巢中的亚细胞定位。结果显示，在罗氏沼虾卵巢中，Mrnanos1 mRNA在卵母细胞中检测到阳性信号，在Oc1、Oc2、Oc3、Oc4期的卵母细胞中阳性信号最强 (图6)，在初级卵母细胞Oc1、Oc2、Oc3、Oc4期的阳性信号主要集中于卵母细胞的细胞质中。

图6 Mrnanos1 mRNA 在罗氏沼虾卵巢中的亚细胞分布注：a. 罗氏沼虾卵巢切片 (HE 染色) ；
b. 罗氏沼虾卵巢切片 (反义探针结果)；
c. 罗氏沼虾卵巢切片 (正义探针结果)；
d、e、f 分别为 a、b、c 中红色方框内的放大视野图。Fig. 6 Subcellular localization of Mrnanos1 mRNA in ovary of M. rosenbergiiNote: a. Ovarian sections of M. rosenbergii (HE staining); b. Ovarian sections of M. rosenbergii (Antisense probe results); c. Ovarian sections of M. rosenbergii (Results of sense probe); d, e and f. The enlarged view in the red box of Fig. a, b and c, respectively.

本研究系统揭示了nanos1在甲壳类动物罗氏沼虾中的表达模式，并对该基因的核苷酸序列与氨基酸序列进行了分析。罗氏沼虾Mrnanos1 cDNA序列全长2 811 bp，共编码243个氨基酸。对于大部分物种来说，Nanos1家族蛋白编码的氨基酸个数在200～300之间，如在海葵中nanos1基因共编码216个氨基酸[21]，中华鲟 (Acipenser sinensis)nanos1共编码228个氨基酸[25]，小鼠[26]和人类[27]的nanos1基因分别编码267和292个氨基酸；
而在果蝇[28]中nanos基因编码的氨基酸个数 (401) 远大于上述物种；
相反，在非洲爪蟾中发现nanos1基因仅编码128个氨基酸[29]，上述研究表明Nanos蛋白家族的氨基酸长度会因物种不同而有所差异。此外，氨基酸序列的遗传进化分析显示罗氏沼虾的MrNanos1蛋白与其他物种的Nanos1家族蛋白聚为一类，并与其他物种的Nanos1氨基酸序列具有较高的相似性，其中与中华绒螯蟹的亲缘性较高，以上结果说明本研究获得的罗氏沼虾nanos1基因属于nanos1家族。此外，本研究也尝试探讨罗氏沼虾是否含有其他不同的nanos家族，设计了不同方案并进行了一系列尝试，结果在罗氏沼虾中并未获得nanos2和nanos3家族相关基因，因此推测罗氏沼虾nanos家族中仅有nanos1一种家族基因，且该基因在罗氏沼虾的生殖发育中发挥着重要作用。

在组织表达分析中，本研究发现Mrnanos1基因除在雌性性腺表达外，其他组织均未检测到表达，这种表达模式与以前报道的并不一致，如中华鲟的nanos1 基因除在肌肉和肠中未见表达外，广泛表达于肝脏、性腺、脾脏、心脏、肾脏等组织中[24]；
同样在无脊椎动物家蚕 (Bombyx mori) 中发现nanos基因也广泛表达于性腺、血液、中肠等组织[30]。本研究的结果证明Mrnanos1基因是一个雌性性腺特异表达的基因，可以作为与罗氏沼虾雌性生殖发育相关的一个特异性标记基因。此外，在分析Mrnanos1在罗氏沼虾未受精卵和不同胚胎发育时期以及幼体期的表达水平时发现，从未受精卵至所有的胚胎发育时期Mrnanos1均有表达，且在未受精卵时期表达量最高，提示Mrnanos1基因是罗氏沼虾的一个母源效应基因，这与在文昌鱼 (Branchiostoma floridae) 中的结果基本一致，nanos1作为一个母源基因均匀分布于卵母细胞的细胞质中[31]。在不同的胚胎发育过程中Mrnanos1表达量在受精后逐渐降低，这与在家蚕中的表达模式几乎相同，nanos在几乎所有不同发育阶段的胚胎中都有表达，且在早期胚胎时期高表达[32]。而蜜蜂 (Apis mellifera) 早期胚胎的表达模式有所不同，其早期胚胎发育过程中有nanos1存在，但其降解较快，在第二阶段之后未见有细胞表达这种生殖细胞标记物，而在3—7期胚胎中未检测到Amnanos1 RNA[33]，这意味着nanos可能具有不同的功能。实验结果表明Mrnanos1的转录本由母体提供，并在早期胚胎发生中发挥重要作用。作为一个母源效应基因，nanos在生殖发育中的具体功能目前仍不明确。如在小鼠中nanos基因的缺失会造成性腺发育不良，无法产生生殖细胞[19]；
同样在线虫中，该基因的缺失会影响生殖细胞的活力[18]。研究还发现，在斑马鱼中，若抑制nanos基因表达或将该基因敲除，PGCs(Primordial germ cells) 无法正常迁移入性腺中，从而导致PGCs凋亡[34]。因此，nanos基因在罗氏沼虾生殖发育中的具体功能仍有待进一步研究。

亚细胞定位是确认目标基因在组织细胞内表达具体位置的有效途径。原位杂交结果显示，Mrnanos1的mRNA并未在罗氏沼虾的雄性生殖细胞中表达(结果略)，而仅仅表达于卵巢的生殖细胞中，且主要分布在Oc1、Oc2、Oc3、Oc4期的初级卵母细胞质中，随着卵母细胞发育成熟，细胞增大，目的信号逐渐分布在核周区域。然而，在人类中却发现nanos基因在男性生殖系维持中发挥着关键作用[35]。这表明nanos1基因的具体功能因物种差异有所不同。在日本血吸虫 (Schistosoma japonicum) 中，nanos1促进卵母细胞的形成和产生，对维护胚胎发育过程中原始生殖细胞的生存发挥着至关重要的作用[36]；
而在线虫中，nanos1能促进原始生殖细胞迁移至胚胎性腺，并维持生殖细胞正常的生长发育[18]。此外，在非洲爪蟾中nanos1 mRNA主要富含于卵母细胞中，对卵母细胞的发育至关重要，若卵母细胞nanos1不表达将会导致生殖系统发育不正常[29]。因此，Mrnanos1基因对罗氏沼虾雌性生殖细胞的发育具有重要功能，并可作为罗氏沼虾卵母细胞的一个生殖发育标记基因。

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